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化妆品中双香豆素和环香豆素的测定HPLC
作者:  浏览量:923  发布时间:2017-12-25 02:56:08

化妆品中双香豆素和环香豆素的测定

一、摘要

本文建立了用高效液相色谱(HPLC)/二极管阵列检测器(DAD)测定化妆品中两种香豆素物质——双香豆素和环香豆素的方法。样品用乙腈一氢氧化钠溶液(0.1moL/L)(体积比9:1)的提取溶液超声提取,高效液相色谱DAD扫描检测,并在306nm波长进行分析。用保留时间结合二种香豆素的紫外光谱定性,外标法定量,并且采用液质联用(LC—MS/MS)确证。双香豆素的回收率为96%~105%,精密度RSD为0.51%~2.08%,定量下限为1ng;环香豆素的回收率为88%一104%,精密度RSD为0.51%一3.36%,定量下限为1ng。


测定指标:双香豆素;环香豆素


二、高效液相色谱仪对化妆品中双香豆素和环香豆素测定意义

香豆素是广泛存在于自然界中的内酯类化合物,尤其在芸香科和伞形科植物中存在最多,常用于日用香精中。在对人体具有抗高血压、抗凝血等药理作用的同时,也具有一定的对生物体有害的生理毒性一。


双香豆素(dicumarol)和环香豆素(cyclocou-marol)属香豆素类物质,分子结构式分别如下图

所示。它们具有草香味,曾被广泛用作香料。但双香豆素和环香豆素具有光毒性,易与紫外线产生作用而变质,对肝脏有损害,同时影响MTT代谢,也影响生物体代谢。另外,双香豆素还会影响生物体NAD(P)H醌氧化还原酶,从而影响细胞间信息传递引。故近年来欧盟和我国都规定双香豆素和环香豆素为化妆品中禁用物质,所以,对双香豆素和环香豆素的检测是保障化妆品质量安全的重要措施。

化妆品中双香豆素和环香豆素的测定高效液相色谱仪

国外的文献偏重于香豆素作为药物在生物体中的代谢机理和生理毒性研究,对其检测方法研究较少。Maurer等采用GC—MS方法,测定了尿液中的4-羟基香豆素及其代谢产物的含量,其中包括环香豆素。而目前国内多数是植物(绝大多数为中草药)提取物中香豆素类物质的定性或定量分析研究。中国药典(95版)采用HPLC分离和检测,操作较复杂,且灵敏度不高。戴平l8采用紫外分光光度法测定了双香豆素片中双香豆素的含量,操作简便,但准确度低。乌云等采用溶剂萃取,薄层色谱分离,紫外吸收光谱定量,测定了草木樨种籽中双香豆素的含量,操作复杂,灵敏度也不高。目前国内尚无同时分离和检测化妆品中双香豆素和环香豆素的报道。本文建立了高效液相色谱仪对化妆品中双香豆素和环香豆素测定方法,用保留时间结合紫外光谱图定性,外标法定量,并且采用液质联用(LC—MS/MS)确证,避免了假

阳性结果的发生,方法准确、快速、简便,检出限、回收率和精密度均符合要求,可用于同时测定化妆品中的双香豆素和环香豆素。


三、化妆品中双香豆素和环香豆素的测定高效液相色谱仪器与试剂准备

科捷高效液相色谱仪(南京科捷分析仪器有限公司),配自动进样器和DAD检测器;

液质联用仪,配自动进样器和工作站;

KQ-600B型超声波清洗仪;

Beckman高速冷冻离心机;

双香豆素(AerosOrganics公司),纯度99%;

环香豆素(Sigma—Aldrich公司),纯度99%;

甲醇、乙腈(Fisher公司),色谱纯;

二氯甲烷、氢氧化钠、乙酸、乙酸铵(北京化学试剂公司),优级纯;

实验用水为Milli-QI级超纯水。


四、化妆品中双香豆素和环香豆素的测定高效液相色谱仪实验条件

1、HPLC/DAD条件:

伊利特KromasilC18色谱柱(250mm×4.6mmi.d.,5m);


2、流动相:

甲醇一乙腈一0.05mol/L乙酸铵水溶液(含0.25%体积分数乙酸);


3、梯度条件:

0~2rain时甲醇一乙腈一0.05mol/L乙酸铵水溶液体积比为5:50:45,2~3rain线性变为5:75:20,3~10rain保持5:75:20,10~12rain线性变为5:50:45,12~15rain保持5:50:45;流速1.0mL/min;选择保存波长190~400nm紫外光谱图。


4、液相色谱一质谱条件:

Lc条件:AtlantisC18色谱柱(150mm×2.1mmi.d.,5m);流动相:水一甲醇;梯度条件:0~

3rain保持水与甲醇体积比为2:8,3~8rain线性变化到0:100,8—15rain保持0:100;流速0.2mL/min;柱温:室温;进样量:10L。


5、双香豆素MS条件:

离子化方式ESI(一);毛细管电压3.5kV;锥孔电压13.0V;Extractor电压2V;RFLens电压1.0V;离子源温度100oC;脱溶剂气温度300oC;数据采集方式:二级离子监测(MRM);监测子离子及其碰撞能量:335.2>116.7(43eV),335.2>160.9(13eV)。


6、环香豆素MS条件:离子化方式ESI(+);毛细管电压3.0kV;锥孔电压25.0V;Extractor电压5V;RFLens电压1.0V;离子源温度100oC;脱溶剂气温度300oC;数据采集方式:二级离子监测(MRM);监测子离子及其碰撞能量:323.2>251.1(20eV),323.2>172.9(25eV)。


五、化妆品中双香豆素和环香豆素的测定高效液相色谱仪标准溶液的配制

准确称取双香豆素和环香豆素各0.OlO0g置于100mL棕色容量瓶中,加入5mL二氯甲烷,待全部溶解后,再加入少许乙腈,超声溶解,再加乙腈定容至100mL,振荡均匀,即得双香豆素和环香豆素质量浓度各为100mg/I~的混合标准储备液,再逐级用乙腈溶液稀释至所需要的浓度。


六、样品前处理

称取化妆品试样0.500g,精确到1mg,加入体积比为9:1的乙腈一氢氧化钠溶液(0.1mol/L)提取,超声振荡20rain,并用1.0mol/L乙酸调节溶液pH值至中性,定容至25mL,混匀。取部分溶液放入离心管中,在离心机上于12000r/rain离心10rain,离心后的上清液经0.45m滤膜过滤,滤液待测定用。


七、化妆品中双香豆素和环香豆素的测定高效液相色谱仪测定结果与讨论

1、流动相的选择

选用甲醇一水作为流动相,不出峰;选用水一乙腈或者水一乙腈一四氢呋喃作为流动相,双香豆素色谱峰较宽,不对称,且拖尾;选用甲醇一水一四氢呋喃,或者水一四氢呋喃作为流动相时,随着四氢呋PiLL例增大峰形逐渐对称,但双香豆素出峰时问逐渐靠前,易与溶剂峰相混,不能同时满足出峰时问与峰形的要求。


在上述各流动相中分别加入0.02、0.04、0.05mol/L的乙酸铵,环香豆素和双香豆素的色谱峰形都较好,加入少量乙酸调节pH值,能使峰形更加对称,但双香豆素和环香豆素两峰相隔太远。因此考虑采用梯度条件,同时为了减缓梯度条件下基线变化,加入少量甲醇,最终适宜的液相条件如“1.2”中所述,分离图谱见图1。


2、检测波长的选择

采用DAD宽波段范围扫描,可在获取色谱分离图的同时在线监测物质的紫外光谱图。在较低紫外波段,背景对检测物质干扰严重;在282nm处二者吸收值都较大,但色谱图不稳定,有时出现负峰;而在306nm处检测峰形对称性较好,双香豆素与环香豆素响应值相近,无其它干扰,基线平稳。选定306nm作为两种香豆素物质的检测波长。


3、样品提取溶剂的选择

由于环香豆素溶于有机溶剂,双香豆素溶于碱性水溶液,故考虑采用水一油复合提取溶剂。对比几种溶剂的提取效率,包括甲醇一0.O1mol/L氢氧化钠溶液(体积比1:1和2:1)、乙腈、四氢呋喃、二氯甲烷、乙腈一二氯甲烷混合溶剂(体积比10:1,10:2,10:3和1:1),最终确定样品提取溶剂为乙腈一氢氧化钠溶液(0.1mol/L)(体积比9:1),提取后用1.0mol/L乙酸调节溶液pH值至中性,提取结果符合要求。


4、定量标准曲线的绘制

以色谱峰的峰面积(A)为纵坐标,与其对应的质量浓度(p,mg/L)为横坐标作图,绘制标准工作曲线,并按信噪比为lO求得定量下限。两种组分的线f生范围、线性方程相关系数及定量下限列于表1。

化妆品中双香豆素和环香豆素的测定高效液相色谱仪

5、精密度与回收率

选择经测定不含有这2种香豆素的不同剂型和用途的彩妆类样品(固体粉状)、护肤类样品(膏

状)、洁肤类样品(乳液状)、香水类样品(液体状)4种空白样品,以样品中含量分别为5.0、50.0、

1000mg/kg3个添加浓度,按上述方法检测并进行8次平行实验,考察方法的回收率和精密度,结果见表2。从表2中可看出,双香豆素的回收率为96%~105%,相对标准偏差在0.51%~2.08%之问;环香豆素的回收率为88%~104%,相对标准偏差在0.5l%~3.36%之间。

图片3


6、LC—MS/MS确证

选择Lc—MS/MS进一步确认样品中的双香豆素和环香豆素。双香豆素和环香豆素标准总离子流和二级子离子质谱图见图3。双香豆素的母离子cH0(m/z335.2)主要被打碎成2个子离子cH50(m/z160.9)、CH0一(m/z116.7);环香豆素的母离子c。H0(m/z323.2)主要被打碎成2个子离子cH0(rn/z251.1)、C。H0(m/z172.9)。通过保留时间以及各子离子之问的丰度比值可以定性确定双香豆素和环香豆素是否存在,排除假阳性结果的产生。同时,Lc—MS/MS方法对于双香豆素和环香豆素的定量下限均能达到1ng。

化妆品中双香豆素和环香豆素的测定高效液相色谱仪

7、化妆品的测定

应用所建立的方法,分别对不同品牌、不同产地、不同剂型(粉末状、块状、膏状、霜状、乳液状、液体状)、不同用途的进出口化妆品中的双香豆素或环香豆素含量进行抽查检测,其中彩妆样品5种,护肤样品4种,洁肤样品2种,发用产品2种,香水产品7种,共20种不同产品。按照建立的测试方法进行检测,测试结果经标准样品比对、DAD验证和LC—MS确证,表明抽查的20种进出口化妆品产品中没有检测到双香豆素或环香豆素。

发现随着cu浓度的增高,LDH荧光强度逐渐降低,并且符合荧光猝灭的Stern—Volmer公式。推测荧光猝灭.的原因是由于金属离子与酶结合而生成了不发荧光的基态络合物,即以热的形式放出多余能量而产生无辐射跃迁。图5为cu对LDH荧光光谱的影响,据此可利用荧光光谱进行金属离子的定量分析。

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